Dados do Trabalho

Título

TERAPIA A LASER DE BAIXA INTENSIDADE PRE INCISIONAL NA CICATRIZAÇAO EM PELE DE RATOS

Resumo

Introdução: O processo de cicatrização envolve fenômenos bioquímicos e fisiológicos e qualquer desequilíbrio pode acarretar em alterações da cicatriz. Objetivo: Avaliar a Terapia Laser de Baixa Intensidade pré incisional na cicatrização em pele de ratos. Métodos: Foram utilizados 90 ratos, distribuídos em três grupos: Grupo Simulação (GS); Grupo Laser Vermelho (GLV) e Grupo Laser Infravermelho (GLIV). Os grupos foram subdivididos em três subgrupos, correspondentes ao 3º, 7º e 14º dias de avaliação. Foi realizada uma ferida incisional no dorso do animal, contendo 3cm. O GS não recebeu tratamento, GLV e GLIV foi utilizada uma energia de 60J por ponto, totalizando três pontos de aplicação, com tempo 600s. As amostras foram coletadas do terço médio da cicatriz e logo após foram coradas por hematoxilina-eosina para identificação de vasos, azul de toluidina para mastócitos e picrosirius para colágeno total. Resultados: Não houve diferença significante com relação à quantidade de vasos e mastócitos entre os grupos e períodos avaliados. Houve diferença significante na avaliação de picrosirius, onde o grupo GS 14º apresentou uma concentração maior de colágeno total quando comparado a GS3º e GS7º. Já os grupos GLV e GLIV 14º apresentaram uma diminuição do colágeno total quando comparado ao GS14º. Conclusão: A Terapia Laser de Baixa Intensidade pré-incisional diminui a quantidade de colágeno total.

Introdução

O processo de cicatrização envolve fenômenos bioquímicos que interagem para que ocorra a reparação tecidual¹ e qualquer desequilíbrio nessa cascata de eventos pode acarretar em retardo da cicatrização, como formação de úlceras2, ou a exacerbação dessas, resultando em cicatrizes fibroproliferativas3.

Os recursos biofísicos, tais como campos
eletromagnéticos, ultrassom e Terapia Laser de Baixa Intensidade (LLLT,
Low Level Laser Therapy), são utilizados a fim de modular o processo de
cicatrização2. A LLLT, nomeada por “fotobioestimulação”, é utilizada no tratamento de uma série de condições, incluindo lesões de tecidos moles, feridas graves, dor crônica, entre outros4. A utilização desse agente biofísico em diferentes comprimentos de onda e doses pode influenciar no efeito estimulatório (baixa energia) ou inibitório (alta energia)5.

Há poucos estudos sobre os efeitos inibitórios, a investigação desses efeitos, seria importante no futuro para o tratamento de cicatrizes fibroproliferativas, que caracterizam-se pela hiperprodução de
fibras colágenas e, secundariamente, pela hiperplasia de fibroblastos6. Ademais, a maioria dos resultados encontrados é advinda de estudos in vitro, que (utilizando a fototerapia de baixa intensidade, em alta energia) relataram a inibição do metabolismo celular, apoptose, inibição da proliferação de fibroblastos, no espectro vermelho e infravermelho, sem alteração na viabilidade celular7.

Portanto, os dados encontrados na literatura em relação ao efeito bioinibitório da LLLT nos modelos in vitro, somados à escassez de estudos in vivo, surgiram questionamentos no sentido de elucidar o comportamento da LLLT aplicada previamente a uma incisão, bem como sua possível biomodulação do processo de cicatrização.

Objetivo

Avaliar a Terapia Laser de Baixa Intensidade pré-incisional na cicatrização em pele de ratos.

Método

Trata-se de um estudo primário, experimental, intervencional, aleatorizado e controlado. Os experimentos tiveram início após liberação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).

Foram utilizados 90 ratos (Rattus norvegicu). Os animais foram acondicionados em gaiolas individuais, em ambiente higienizado, recebendo água ad libitum e ração própria, com ciclo claro-escuro de 12h e temperatura constante de 22°C.

A randomização foi realizada por meio do site www.randomization.com. Os
animais foram distribuídos em três grupos, com 30 ratos, cada: Grupo
simulação (GS) no qual foi realizada simulação da aplicação do laser,
com o aparelho desligado; Grupo Laser Vermelho (GLV) e Grupo Laser Infravermelho (GLIV) o qual foi realizada a aplicação do laser vermelho e infravermelho, respectivamente, por 5 dias consecutivos. Posteriormente, foi realizada uma incisão no dorso de todos os ratos; cada grupo supracitado foi subdividido em três subgrupos contendo 10 ratos, cada, que foram avaliados em três tempos (3°, 7° e 14° dias, respectivamente).

Foi utilizado o aparelho emissor laser Thera Lase® da DMC Equipamentos Ltda. Após a epilação do dorso do animal, foi utilizado outro gabarito de acetato (2x5cm), contendo três aberturas de 3mm, equidistantes de 1cm. A aplicação da LLLT foi realizada de modo pontual, com contato e perpendicular à incisão, utilizando uma DE: 2143J/cm2, t:600s, E/por ponto: 60J e E/total: 180J, para os grupos GLV e GLIV. No grupo GS, foi utilizado t:600s com o equipamento desligado

Após 24h do último dia de tratamento, no 6º dia, foi realizada incisão crânio-caudal, na linha mediana dorsal, até a fáscia muscular, sobre linha demarcada previamente de 3cm que continha 2 pontos equidistantes de 1cm a partir das extremidades. A incisão foi suturada nos 2 pontos equidistantes com pontos simples de fio monofilamentar de náilon 4-0. As amostras foram coletadas no ⅓ médio da incisão, sob formato retangular de 1x2cm, no 3°, 7° e 14° dia. Após obtenção dos tecidos, os animais foram submetidos à morte induzida com superdosagem da mistura anestésica, seguida de secção dos grandes vasos cervicais.

O material coletado foi processado histologicamente conforme protocolo do Laboratório de Patologia da UNIFESP e emblocado em parafina. Os cortes histológicos com 5μm de espessura foram corados pela técnica histoquímica de hematoxilina e eosina (HE) para identificação de vasos, azul de toluidina para mastócitos e picrosirius para colágeno total.

Foi realizada uma análise descritiva da análise quantitativa de vasos e mastócitos. Logo após, foi realizada uma análise inferencial, utilizando o modelo de análise de variância com dois fatores fixos para avaliar a diferença entre as medidas feitas nos grupos e períodos estudados.

Os dados obtidos das análises quantitativas de colágeno total foram expressos em Média ± Desvio Padrão (DP). Os grupos foram comparados por meio do teste para análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey para observar se ocorreram diferenças entre os grupos. O nível de significância para a rejeição da hipótese nula foi de p≤0,05. Foi utilizado o programa GraphPad Prism 5.0 (San Diego, California USA).

Resultado

A estatística descritiva para vasos e mastócitos está apresentada na
Tabela 1 e 2 (em anexo). As observações dos resultados, apresentados na Tabela 3 (em anexo), permitem afirmar que não houve diferença com relação aos grupos e períodos para as variáveis estudadas.

Na tabela 4 (em anexo) está apresentada a análise descritiva para avaliação dos grupos GS, GLV e GLIV, segundo a birrefringência do colágeno total em valores percentuais nos períodos de 3, 7 e 14 dias. Quando comparados os períodos de avaliação dentro de cada subgrupo estudado, somente houve diferença significativa no GS, sendo observado um aumento do colágeno total no GS 14º, quando comparado com o subgrupo GS 3º e GS 7º. Já na comparação entre os grupos houve uma diminuição significante do GLV 14º e GLIV 14º em relação ao GS 14º, porém não houve diferença significativa entre o GLV 14º e GLIV 14º.

Discussão

Os comprimentos de onda que abrangem o espectro vermelho e infravermelho são os mais pesquisados8. No que concerne ao espectro vermelho e infravermelho, estudos in vitro têm demonstrado que doses mais elevadas e aplicadas repetidas e seguidas vezes possuem efeito inibitório na proliferação celular, sobretudo de fibroblastos9. Esses achados motivaram a realização desse estudo a fim de investigar se tal comportamento inibitório seria observado no modelo in vivo, com aplicação da LLLT previamente a uma incisão cutânea, uma vez que não foram encontrados estudos nesse sentido nas buscas realizadas.

O rato é muito utilizado como modelo animal em estudos que envolvem cicatrização de pele e de retalhos. A escolha da região dorsal foi baseada em estudos prévios10, por se tratar de região de fácil acesso para pesquisadores, além de evitar que o animal alcance a ferida.

Sabe-se que o mecanismo de ação da fototerapia depende do comprimento de onda utilizado e da energia total ofertada9, que influenciam diretamente no metabolismo mitocondrial, agindo em cromóforos da membrana e da cadeia respiratória7. Nesse sentido, há relatos na literatura, de estudos in vitro, de que o comprimento de onda vermelho e infravermelho, além do efeito
estimulatório no processo cicatricial, pode ainda exercer efeito inibitório11. Já para estudo in vivo, observou-se que uma energia alta de 60J, no comprimento de onda infravermelho, aplicada por cinco dias consecutivos em ferida incisional em ratos, foi eficiente no aumento do retardo óptico das fibras de colágeno da cicatriz e pele adjacente e reduziu colágeno do tipo I no 7º e 14º dia de avaliação10. Entretanto, não foram encontrados na literatura estudos in vivo que descrevessem a aplicação da LLLT no período pré-operatório de ferida incisional, utilizando alta energia. O que poderia ter relevância clínica no tratamento e prevenção de cicatrizes fibroproliferativas, caracterizadas pelo aumento da quantidade e expressão dos fibroblastos3. Assim, empregou-se, no presente estudo, a energia total de 60J, conforme estudo de BONATTI et al., (2013), maior dose encontrada em estudo realizado in vivo, até o início da fase experimental do presente estudo.

Com relação à avaliação de vasos sanguíneos, não houve diferença significativa para o tempo de avaliação no período de 3, 7 e 14 dias em cada subgrupo. Assim como, ao comparar os grupos GS, GLV e GLIV, a análise também não revelou diferença significativa nos tempos de avaliação. Já no estudo de BONATTI et al. (2013), que utilizou as mesmas doses do presente estudo, foi observado que o número de vasos foi menor no 14º dia, quando comparado ao 7º dia de avaliação, após a utilização de baixa (1,5J) e alta energia (60J) em ferida incisional

Com relação à avaliação de mastócitos, não houve diferença significativa para o tempo de avaliação no período de 3, 7 e 14 dias em cada subgrupo. Assim como, ao comparar os grupos GS, GLV e GLIV, a análise também não revelou diferença significativa nos tempos de avaliação, demonstrando que a aplicação da LLLT previamente a uma incisão não altera a quantidade de mastócitos quando comparado ao padrão fisiológico. Segundo BERGLUND et al. (2010) o aumento da quantidade de mastócitos pode contribuir para o desenvolvimento de fibroses e, por conseguinte, o aparecimento de cicatrizes hipertróficas.

No presente estudo foi observado que o grupo simulação, nos três períodos avaliados, comportou-se dentro do padrão fisiológico, sendo que no 14º dia foi encontrada uma concentração maior de colágeno total quando comparado aos subgrupos do 3º e 7º dias avaliados. Os grupos irradiados não apresentaram o mesmo padrão. O que corrobora com o estudo de BONATTI et al. (2013) que realizaram um estudo in vivo, e observaram que energia alta de 60J, no comprimento de onda infravermelho, aplicada por 5 dias consecutivos em ferida incisional em ratos, aumentou o retardo óptico das fibras de colágeno da cicatriz e pele adjacente e reduziu a quantidade de colágeno do tipo I no 7º e 14º dia de avaliação.

Sendo assim, as relevantes reduções do colágeno constatadas neste estudo corroboram com os relatos do efeito dose-dependente e cumulativo da LLLT9. Esse achado pode ser relevante para tratamento de cicatrizes hipertróficas e quelóides.

Conclusão

A Terapia Laser de Baixa Intensidade, no período pré-incisional na cicatrização em pele de ratos, diminui a quantidade de colágeno total no 14º dia.

Referências

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7 Bonatti S, Hochman B, Tucci-Viegas VM, Furtado F, Pinfildi CE, Pedro
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9 Houreld NN, Abrahamse H. Laser light influences cellular viability and
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10 Bonatti S. Terapia a laser de baixa intensidade (808 nm) em baixa e alta
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[São Paulo]: Universidade Federal de São Paulo; 2013.102p.

11 Lev-Tov H, Mamalis A, Brody N, Siegel D, Jagdeo J. Inhibition of
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12 Berglund ME, Hildebrand KA, Zhang M, Hart DA, Wiig ME.
Neuropeptide, mastcell, and myofibroblast expression after rabbit deep
flexor tendon repair. J HandSurg Am. 2010 Nov;35(11):1842-9.

Palavras Chave

cicatriz; LASER; colágeno

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